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怎样选择色谱柱

日期:2021-10-25 12:22
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摘要:

现代高效液相色谱中,分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。但

是色谱填料的选择范围很宽,要做合适的选择,必须对此有一定的认识和了解。

 

1、正相色谱

正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica),以及其他具有极性官能团,如胺基团

(NH2,APS)和氰基团(CN,CPS)的键合相填料。

  

由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他团的极性较强,因此,分离的次序是依据样品

中的各组份的极性大小,即极性强弱的组份*先被冲洗出色谱柱。

正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低,如:正乙烷(Hexane),氯仿

(Chloroform),二氯甲烷(Methylene  Chloride)等。

 

2、反相色谱

反相色谱填料常是以硅胶为基础,表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。

反相色谱所使用的流动相极性较强,通常为水,缓冲液与甲醇,已腈等混合物。

样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合*先被冲出,而极性弱的组份会在色谱柱上有

更强的保留。

常用的反相填料有C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)等。

 

二、聚合物填料

聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等,其主要优点是在PH值为1~

14均可使用。

相对与硅胶基质的C18填料,这类填料具有更强的疏水性;大孔的聚合物填料对蛋白

质等样品的分离非常有效。

现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料,色谱柱柱效较低。

 

三、其他无机填料

其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质,一般**于特殊的

用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基

键合相,石墨化碳的表面即是保留的基础,不再需其它的表面改性,该柱填料一般比烷基

键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强,石墨化碳可用于分离某些几何导构体,又由

于HPLC流动相中不会被溶解,这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC,

氧化铝微粒刚性强,可制成稳定的色谱柱柱床,其优点是可在PH高达12的流动相中使用。

但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强,应用范围受到一定的限制,所以未能广泛应用,

新型氧化锆填料也可用于HPLC,商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱,应

用PH范围1~14,温度可达100℃。由于氧化锆填料几年才开始研究,加之面临的实验难

度,其重要用途与优势尚在进行中。

 

 

怎样选择填料粒度

 

目前,商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售,而目前分析分离主要用3um、

5um和10um填料,填料的粒度主要影响填充柱的两个参数,即柱效和背压。粒度越小,填

充柱的柱效越高;小于3um的填料应用,在相同选择性条件下,提高柱效可提高分离度,

但不是唯壹的因素。如果固定相选择是正确,但是分离度不够,那么选择更小粒度的填料

是很有用的,3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%;然而,

3um的色相谱的背压却是5um的2倍。与此同时,柱效提高意味着在相同条件下可以选择更

短的色谱柱,以缩短分析时间,另外,可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使

用温度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色谱柱的压力。

 

一、如何保证良好的柱性能与柱寿命

◆ 认证阅读色谱柱使用说明书;

◆ 使用填充良好的色谱柱;

◆ 尽量减少压力波动,避免机械及热冲击;

◆ 使用保护柱及在线过滤器;

◆ 经常以强溶剂冲洗色谱柱;

◆ 充分过滤样品及流动相,尽量避免杂质微粒与强保留成分;

◆ 用稳定的固定相(C18*稳定);

◆ 在中等PH值操作(6~8),用有机缓冲溶液;

◆ 色谱柱使用温度*好小于40℃;

◆ 硅胶基质的的色谱柱,应保持流动相的PH值范围在3.0~8.0;

◆ 在水流动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠;

◆ 流动相中含有缓冲溶液,应注意应95∶5的水及有机溶剂过渡,有机溶剂不能低于5%;

◆ 过夜或贮存时,冲洗掉盐和缓冲液,用纯有机溶剂流动相保存(乙晴*好)。

 

HPLC固定相及应用范围

名称    别名      功能基团   正相  反相  离子对  应用
 
Silica                     -OH           √                         非极性和中等极性以及非离子性有机化合物。
 
SAS   C1             -(CH3)3               √                在所有的烷基键合相中对非极性化合物保留*

                                       弱,典型用于中等极性和多官能团化合物.
 
Butyl  C4              -C4H9                 √    √       分离肽和蛋白质,保留时间比C8和C18短。
 
MOS  C8,         -C8H17                 √     √      中等极性相中对中等化合物,小肽和蛋白质,

          Octyl                                                           极**族化合物和环境样品。
 
ODS  C18            -C18H37              √     √       烷基键合相中对中等极性化合物保留*强。广

                                       泛用于**,甾族化合物,脂肪酸和环境样品.
 
CPS   CN ,Cyano  -(CH2)3CN      √    √          对极性化合物有独特的选择性,适合应用于正相

(propyl                                                       分离,当用于反相系统时,其选择性与  C8和

Nitrile)                                                       C18不同,在药学领域和复杂混合物的分离中应

                                用广泛。
 
APS  NH2            -(CH2)3 NH2     √    √         反相中分析糖类和其他极性化合物。弱阴离子交

         (AminoPropyl)                                              换 ,阴离子和有机酸则应用缓冲剂和有机改性

                                       剂 做流动相。正相中与硅胶的选择性机改性剂

                                       不同,分析芳香族效果很好。
 
Phenyl                    -(CH3)C6H5             √     √  芳香族化合物
 
Diol                        -(CH2)2O      √     √      反相时,分离肽和蛋白质。正相时,与硅选择

                              CH2(CH2OH)2                                性 相似,但极性较弱。
 
SCX  强阳离子    -(CH2)2C6H4SO3H-            √  有机碱

交换
 
SAX  强阴离子     -(CH2)3N+(CH3)3       有机酸,核苷和核苷酸

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